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利用化学交联质谱和结构计算来研究蛋白质动态

2019-09-22 09:12栏目:新闻中心
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钙调蛋白是一种信号蛋白,它能与300多种靶标结合并把钙离子信号传递到各种生物过程,从而实现基因调控、细胞骨架组织、肌肉收缩、信号转导、代谢调控等多种功能。探索钙调蛋白与多种靶标的多特异性识别的分子机制对理解这些生物过程至关重要。

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对于CXMS实验而言,蛋白样品中两个氨基酸之间发生交联反应,必须满足交联剂的化学特异性要求以及空间距离小于或等于交联剂臂长的要求。因此,由CXMS获得的交联位点对提供了可用于结构计算的距离约束信息。作为结构生物学的新工具,特别是单分子电镜技术的辅助工具,CXMS在很多大型蛋白质复合体的结果解析中做出了贡献。但该技术最令人困扰的问题是:即便用最严苛的筛选标准,总有小部分交联位点对在晶体结构中的距离大于交联剂臂长("over-length"chemical cross-links)。对于此类数据,大部分实验室选择丢弃或者放松距离约束。

中国化工仪器网 技术前沿】中国科学院上海药物研究所吴蓓丽研究员和赵强研究员在蛋白质结构解析方面再次斩获成果:测定了胰高血糖素受体全长蛋白与多肽配体复合物的三维结构,揭示了胰高血糖素受体对细胞信号分子的特异性识别及其活化调控机制。相关论文于北京时间1月4日凌晨发表在国际学术期刊《自然》。 蛋白质作为生命活动的承载体及功能执行者,科学家们对其“真面目”始终保持好奇。在X射线衍射、核磁共振及近年来大火的冷冻电镜等技术的不断进步之下,蛋白质结构解析也日益成为科学界的“宠儿”。 近,中国科学院上海药物研究所吴蓓丽研究员和赵强研究员在蛋白质结构解析方面再次斩获成果:测定了胰高血糖素受体(Glucagon receptor, GCGR)全长蛋白与多肽配体复合物的三维结构,揭示了胰高血糖素受体对细胞信号分子的特异性识别及其活化调控机制。相关论文于北京时间1月4日凌晨发表在国际学术期刊《自然》。 吴蓓丽在接受澎湃新闻(www.thepaper.cn)采访时表示,"我们解析的蛋白是B型G蛋白偶联受体,这种蛋白比较大,结构解析相对来说比较难,这项工作也是对去年5月份成果的深入推进。"此前的2017年5月,吴蓓丽课题组同样在《自然》发文,报道了全长B型G蛋白偶联受体晶体结构。 值得注意的是,这是吴蓓丽课题组近年来在《自然》、《科学》这样的学术期刊上主导发表的第六篇论文。吴蓓丽于2006年获清华大学生物物理专业博士学位,2007年至2011年在美国Scripps研究所进行博士后工作。2011年回国加入中国科学院上海药物研究所,并于同年入选中国科学院“百人计划”。现任中科院上海药物研究所研究员、课题组长。 2011年回国以来,吴蓓丽长期从事G蛋白偶联受体结构生物学的研究工作。曾解析了艾滋病病毒共受体CXCR4和CCR5的结构,同时开展基于CCR5结构的药物研发,目前已获得药效显著优于上市药物的候选药物。此外,还解析了抗血栓药物靶标P2Y1R和P2Y12R的结构,发现位于受体分子外表面的全新配体结合位点。 1高度模拟受体蛋白功能状态 G蛋白偶联受体是人体内大的膜受体蛋白家族,在细胞信号转导中发挥重要作用。这一蛋白家族与人体疾病关系密切,目前有40%以上的上市药物以该类受体蛋白为靶点。 根据其相似性,G蛋白偶联受体可分为A、B、C和F等四种类型。其中,B型G蛋白偶联受体包括胰高血糖素等多种重要的受体蛋白,识别并结合多肽类激素,对于维持体内激素平衡至关重要。 吴蓓丽对澎湃新闻表示,"胰高血糖素受体蛋白是治疗2型糖尿病药物的一个重要靶点,在人体内参与调解血糖平衡,在人体处于饥饿状态下,这个受体蛋白可以提高人体血液内的血糖浓度。"然而,其结构信息的缺失严重制约了对该受体信号识别和转导机制的认识,这也直接导致了目前尚无靶向胰高血糖素受体的药物上市。 实际上,去年5月份在《自然》刊发论文同样是解析了胰高血糖素受体蛋白的结构。不同之处在于,因前后两次结合的配体不同,受体蛋白活化状态产生了变化。 “之前我们解析的是胰高血糖素受体蛋白同时与一种抗体和一种小分子配体结合的复合物结构,这里面的抗体和小分子配体都是受体蛋白的抑制剂,所以整个受体蛋白是处于非激活状态的,也就意味着没有活性没有功能。” 吴蓓丽解释,"G蛋白偶联受体发挥它的功能,主要是要识别人体内不同的细胞信号分子,并与之相互结合。"为探究这一生物学功能状态下的受体构象,课题组解析了和此前不一样的复合物晶体结构,这一复合物除了胰高血糖素受体蛋白,还包括了一种多肽类配体NNC1702。 "B型G蛋白偶联受体识别的信号分子就是多肽,而且我们结构里的多肽配体实际上就是它要识别的天然信号分子的一个高度类似物。所以这个结构就能比较直接地告诉我们,这个受体蛋白是如何识别细胞信号的。“吴蓓丽对此评价,”这确实是我们取得的一次比较重要的进展。" 2从未被发现的“连接肽作用” 获得高质量的复合物蛋白之后,吴蓓丽课题组借助X射线晶体衍射技术,获得了分辨率为 3.0 Å的高精度全长蛋白结构。 一般来说,B型G蛋白偶联受体包含胞外结构域和跨膜结构域,两者共同参与识别细胞信号。研究团队在以往的研究中曾发现,胰高血糖素受体中连接胞外结构域和跨膜结构域的肽段,通过与受体蛋白其他区域的相互作用在受体活化调控中扮演关键角色。 在此番研究中,吴蓓丽及其同事分析了胰高血糖素受体与多肽配体NNC1702结合的复合物结构,并与以往解析的全长胰高血糖素受体结构进行比较。吴蓓丽提到,“我们这次的工作集中在,这个蛋白受体如何识别细胞信号?怎么通过受体自身的构象变化对这个信号进行调控?” 研究人员发现,上面提到扮演关键角色的连接肽段在受体结合多肽配体时发生了显著的构象变化。其蛋白质二级结构由β折叠转变为α螺旋,并伴随结构的迁移,使胰高血糖素受体的胞外结构域和跨膜结构域之间的相对取向发生了巨大变化,从而促进胰高血糖素受体与多肽配体NNC1702的紧密结合,导致胰高血糖素受体激活。 此外,该连接肽通过与多肽配体中段区域的相互作用对受体跨膜结构域的构象进行精细调节,进而调控受体活化。 全长GCGR结构示意图:GCGR参与调节体内血糖稳态,是治疗2型糖尿病药物的重要靶点。左图为全长GCGR蛋白与小分子变构调节剂NNC0640以及拮抗性抗体mAb1结合的复合物晶体结构;右图为全长GCGR蛋白与多肽配体NNC1702结合的复合物晶体结构。两个结构以飘带图和表面图表示,GCGR的跨膜结构域为蓝色,胞外结构域为橙色,连接肽为绿色,个胞外环区为紫红色,NNC1702为红色,NNC0640为黄色,抗体mAb1为蓝绿色。细胞膜以灰色区域表示。 赵强表示,"虽然只含12个氨基酸,但这个连接肽却发挥着如此重要的作用,这在过去的G蛋白偶联受体结构研究中从未被发现过,使我们对B型G蛋白偶联受体的信号调控机制有了更为深入的认识"。 基于胰高血糖素受体与NNC1702结合的复合物结构,该团队还运用受体配体竞争结合、计算机模拟和双电子共振等多种技术手段开展了一系列功能性研究,阐明了胰高血糖素受体在不同功能状态下构象的动态变化,并对受体活化的调控机制进行了深入的探究。 3已开展药物研发 信号转导及调控机制解决后,目标在于2型糖尿病的新药研发。实际上,蛋白质结构解析正是药物研发的关键一步。 吴蓓丽课题组此番获得的进展对药物研发究竟意味着什么?"我们针对这个胰高血糖素受体蛋白进行药物研发的话,就是要找到这个受体蛋白的抑制剂,把受体功能抑制住,降低血糖浓度,这样就可以治疗2型糖尿病了。" 吴蓓丽表示,“这次复合物结构里的配体分子和天然的多肽信号分子是高度相似的,根据我们解析的这个结构就知道这个信号分子是怎样和受体蛋白相互作用,设计的药物要在人体内发挥作用,直接的是能抑制这个受体蛋白和信号分子间的相互作用,那也就可以抑制这个受体的功能了。” 值得一提的是,论文中提到,此前已有研究人员解析了三种B型G蛋白偶联受体和多肽配体复合物的结构,但受限于分辨率不高,多肽配体和B型G蛋白偶联受体结合的特殊分子间相互作用依然很模糊。 吴蓓丽称,“精度低的话就会严重影响药物设计的可靠性,会为药物研发带来很多困难。精度一旦提上去以后就可以为药物设计提供精度比较高的模板,用这个模板来有针对性地设计化合物。” 据了解,中科院上海药物研究所目前已组织团队联合攻关,开展2型糖尿病新药的研发工作。 此外,针对胰高血糖素受体完整的信号调控机制尚未被明确阐明的现状,吴蓓丽表示,“目前我们的研究主要集中在胞外结构域和连接肽部分的构象变化,然而这个区域的构象变化是如何传导到细胞内的?也就是说整个构象的联动过程目前还不清楚。受体蛋白也不可能分区域割裂开来,它是一个整体,构象调控一环扣一环,还是要放在一个整体来研究,未来会在信号转导机制方面进一步深入。” 编辑点评 据悉,该团队还运用受体、配体竞争结合,计算机模拟和双电子共振等多种技术手段开展了一系列功能性研究,阐明了GCGR在不同功能状态下构象的动态变化,并对受体活化的调控机制进行了深入探究。专家表示,这项成果有助于深入理解B型GPCR发挥生理效应的结构生物学基础,加快Ⅱ型糖尿病新药的开发。 (原标题:中科院新Nature,助推糖尿病新药研发!)

汪劲课题组通过构建介观构象转变模型,用分子动力学的方法研究了同时涉及的钙调蛋白质局部构象变化和结合靶标全局构象变化的结合过程。对于钙调蛋白和结合靶标的识别过程,他们发现了非典型“诱导拟合”、非典型“构象选择”和“同时结合折叠”的混合能量地貌景观,并揭示了这种混合机制和钙调蛋白与多种靶标多特异性结合的重要联系。进一步研究发现,这种复杂机制是由于分子间各种潜在相互作用和生物分子柔性的协调作用所决定。钙调蛋白经过生物进化而来的天然结构和其靶标特殊的天然结构,会导致其结合过程选择各种不同但最优的结合方案,最终导致了高亲和力和特异性,这无疑使生物分子间多特异性结合的概率大大增加。

泛素是一种广泛存在于真核细胞内的信号蛋白,泛素化修饰是生物体内最普遍的翻译后修饰之一,多个泛素通过不同方式的共价连接形成的泛素链在溶液中采取不同的构象识别各自的靶蛋白,从而在细胞内分别扮演着不同的角色。其中第63位赖氨酸连接的泛素链主要参与DNA的损伤修复、多泡体介导的蛋白质分选、NF-κB信号通路、氧化应激等生物学过程。之前的许多研究已经表明这种泛素链在溶液中只存在开放态,与某些靶蛋白结合后才以闭合态形式存在。闭合态是靶蛋白诱导而发生构象变化导致,还是一开始就存在,对于第63位赖氨酸连接的泛素链识别靶蛋白背后的分子机制一直不清楚。

两个实验室一年前合作发现分子间的高可信度过长交联反映了蛋白-蛋白间的弱或瞬时相互作用(Gong Z,Biophysics Reports 2016)。该文重点研究分子内不同结构域之间的相对运动。实验结果表明,分子内的高可信度过长交联来源于蛋白质的激发态构象;它们不是制造麻烦的问题数据,而是“众里寻他千百度”的反映蛋白质结构动态的珍贵信息。作者通过交联数据和结构计算发现,结合了钙离子但没有结合配体肽段或蛋白的钙调蛋白除了采取哑铃状的开放态构象,还有一种闭合态构象,非常接近之前用NMR手段观察到的激发态构象。这种闭合态构象与结合了各种配体的Ca2+-CaM晶体结构或NMR结构也非常相似,说明配体肽段或蛋白的结合稳定了原已存在的Ca2+-CaM的闭合态构象。

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该工作得到了科技部、国家自然科学基金委,以及美国霍华德·休斯医学研究所基金的支持。

近日,中国科学院武汉物理与数学研究所研究员唐淳带领的生物大分子动态学研究团队和北京生命科学研究所董梦秋研究组合作,在《生物化学杂志》(The Journal of Biological Chemistry)发表题为Modeling protein excited-state structures from"over-length"chemical cross-links的研究论文,成功探索了利用化学交联质谱(chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry,or CXMS)和结构计算来研究蛋白质动态的新途径,并发布了通用流程。

这项研究为蛋白质与蛋白质多特异性结合这一课题提供了一个全局的量化的物理机制,丰富了人们对生物分子相互识别作用的认识。

近日,中国科学院武汉物理与数学研究所研究员唐淳课题组及合作者在泛素链识别靶蛋白的分子机制研究中有了重要发现,相关成果发表在elife上。

该文还用同样方法研究了细菌磷酸转移系统中的蛋白EIN和谷氨酰胺结合蛋白QBP,发现它们均含有基态构象之外的一种激发态构象。已发表的NMR研究表明,Ca2+-CaM的激发态构象在溶液中所占的比例小于5%;EIN和QBP的激发态构象很可能由于丰度过低未能被NMR检测到。这说明CXMS-DynaXL方法可以灵敏地检测到溶液中的低丰度构象,灵敏度达到甚至超过NMR,且不受蛋白大小限制,可以广泛应用于蛋白质动态变化研究。

非典型“诱导拟合”、非典型“构象选择”和“同时结合折叠”的混合的能量地貌

核磁共振是研究生物大分子在溶液中构象动态变化的一种强有力手段。唐淳及合作者采用顺磁弛豫增强的方法并通过结构计算发现第63位赖氨酸连接的泛素链在溶液中存在很大比例的闭合态构象,对闭合态构象进一步分析发现它们至少可分为两类,分别可以与不同的靶蛋白结合。这项研究为这一泛素链在溶液中存在闭合态提供了直接的实验证据,并首次在原子水平描述了各种闭合态构象的结构信息,解释了泛素链与靶蛋白识别的分子机制。为进一步研究揭示其他种类的泛素链是否也通过构象选择的机制识别相应的的靶蛋白打下基础。

在该文接收发表的同时,由研究团队提交的封面设计也从众多候选稿件中脱颖而出,被The Journal of Biological Chemistry杂志社选中作为期刊封面,并于1月27日刊印出版。出版日期恰逢中国农历除夕,这也是一份最好的新年礼物。

中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室研究员汪劲和吉林大学物理学院博士研究生刘飞,通过分子动力学模拟的方法,提出了钙调蛋白与其靶标在生物分子识别过程中混合的能量地貌景观和机制,并揭示了这种混合机制和钙调蛋白与多种靶标多特异性结合的重要联系。该成果在《美国国家科学院院刊》(PNAS, 114, E3927–E3934, 2017)上发表。

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该文建立了一套基于交联数据的结构模拟计算方法,内容包括:用15N同位素标记的蛋白与天然同位素标记的蛋白等量混合后进行交联质谱分析,从中得到高可信度的分子内交联数据,然后用专门开发的DynaXL软件进行构象模拟计算。DynaXL包含结构域识别、模拟交联反应、分子动力学模拟等多个模块,并采用友好的可视化用户界面。它首先尝试用基态构象模拟交联反应,如果不能满足全部交联约束,则添加一个构象,直到所有交联约束都得以满足。同类其它算法只考虑单一构象,试图让单个构象满足所有交联数据;当蛋白质在溶液中存在多种构象时,容易造成过拟合,得到错误结构。(DynaXL下载链接:

K63-diUb2在未结合靶蛋白时在溶液中存在30%的open态和70%的close态,并通过构象选择机制识别各自的靶蛋白,其中Rap90/tUIM结合open态di-Ub2参与DNA损伤修复;TAB2/NZF与A20/ZnF4结合不同的close态分别参与NF-κB信号通路的激活与终止。

武汉物数所副研究员龚洲和董梦秋实验室的博士后丁曰和为论文共同第一作者。武汉物数所助理研究员刘侃负责了DynaXL软件的设计工作。这项研究得到了科技部、国家自然科学基金委、美国霍华德休斯医学研究所基金和北京市政府资助。

到目前为止,结构生物学研究主要关注蛋白质的基态结构,但是蛋白质行使功能往往需要在基态和激发态之间转变构象。解析蛋白质的激发态构象和结构动态(protein dynamics)对于X射线晶体学和电镜等传统的结构生物学方法是一大难题。核磁共振虽然适合研究蛋白质在溶液中的多种构象,但是仅限于50 kDa以下的蛋白,而且需要大量的、同位素标记的、高度纯化的蛋白。

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